立体显微镜通常被称为实验室或生产现场的“主力军”。用户花费大量时间通过目镜检查,观察,记录或解剖样本。仔细评估需要立体显微镜的相关应用程序是持久,令人满意的使用的关键。决策者需要确定他们可以完全根据自己的需求定制工具。为了帮助用户在选择体视显微镜时做出决策,此处重点介绍要考虑的主要因素。
立体显微镜历史的简短概述
1890年左右,美国生物学家和动物学家Horatio S. Greenough提出了一种光学仪器的设计原理,该原理至今仍被所有主要制造商所采用[1-3]。基于“ Greenough原理”的立体显微镜可提供高质量的真实立体图像。1950年代后期,博士伦(Bausch&Lomb)提出了其StereoZoom®Greenough设计,该设计具有突破性的创新:无级放大(变焦)变换器[3]。几乎所有现代体视显微镜设计都基于缩放系统。1957年,美国光学公司推出了基于望远镜或CMO(通用主要物镜)原理的光学立体显微镜[3]。除了Greenough型之外,由于其模块化和高性能,所有制造商很快都提供了这种体视显微镜。
体视显微镜可能是一笔巨大的投资,因此,选择过程应非常认真。为了充分利用显微镜,用户应该问自己以下问题:
立体显微镜的总放大倍率是物镜,变焦光学镜和目镜的总放大倍率[4]。 物镜具有固定的放大倍率值。仪器的变焦光学器件允许在变焦倍数范围内更改放大倍率。目镜也具有恒定的放大率值。 为了找出通过目镜观察到的物体的放大倍率,必须将物镜,变焦光学镜和目镜的放大倍数相乘。
总放大倍率的公式为:M TOT VIS = M O x z x M E,其中: M TOT VIS是总放大倍率(VIS代表“视觉”); M O是物镜的放大倍率(对于不带辅助镜的Greenough系统,则为1倍); z是缩放系数;和 中号Ë是目镜的放大倍率。
通常,M O的值在0.32x到2x之间,z的值在0.63x到16x之间,M E的值在10x到40x之间。
放大倍率对物场的影响 观察目镜时,称为物场的圆形区域变得可见[4]。物场的直径取决于总放大率。例如,放大倍数为10倍的目镜的场号为23。该场号表示在物镜和变焦光学器件的放大倍数为1倍的情况下,通过目镜观察到的物场直径为23毫米。
景深由数值孔径,分辨率和放大倍率之间的相关性确定[5-7]。 为了获得最佳的物体可视化效果,适当调整现代显微镜的设置可以在景深和分辨率之间达到最佳平衡。尤其是在低放大倍率下,可以通过停止(即减小数值孔径)来显着增加景深。因此,要根据物体特征的大小和形状找到分辨率和景深的最佳平衡。
利用FusionOptics技术实现高景深和高分辨率利用 Leica Microsystems的FusionOptics技术[8]实现了一种立体显微镜的精密光学方法,该方法可以同时实现高分辨率和高景深[8]。通过一条光路,观察者的一只眼睛可以看到具有更高分辨率和更低景深的物体图像。同时,另一只眼睛通过另一条光路以较低的分辨率和较高的景深看到了同一物体的图像。人脑将两个单独的图像组合为一个具有高分辨率和高景深的最佳整体图像。
色差是一种畸变,其中镜头无法将所有颜色聚焦到同一会聚点[2,9]。发生这种情况是因为透镜对于不同波长的光(透镜的色散)具有不同的折射率。当在远离其中心轴的点处撞击球面透镜表面的光线的折射程度比在靠近中心的点处入射的光线折射程度更大或更小时,就会发生球差。良好的光学设计的目的是完全减少或消除色差和球差。可以使用以下镜头来限制这些问题的影响:
消色差镜片
复消色差镜片
平面镜
工作距离是物镜在对准焦点时前透镜与样品顶部之间的距离。通常,物镜的工作距离随放大倍率的增加而减小。工作距离直接影响立体显微镜的可用性,尤其是对于检查和质量控制任务。
通常,人们的身体大小和工作习惯差异很大。因此,配备有特殊附件和特定工作距离的用于特定任务的显微镜的高度(目镜)可能并不适合每个用户。如果观看高度过低,观察者将在工作时被迫向前弯曲,从而导致颈部区域出现肌肉拉紧[10-12]。为了补偿这些高度差,建议使用可变的双目镜筒[10]。由于采用了模块化产品方法,具有CMO设计的体视显微镜提供了多种根据用户的尺寸或工作习惯定制仪器的方法,因此是首选的解决方案。
对于立体显微镜,正确的照明是关键因素[13]。最适当的照明将使目标样本特征以最佳方式可视化,并可能显示新信息。重要的是,照明对于所用的显微镜和预期的应用都必须工作良好。