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选择立体视显微镜时要考虑的关键因素

作者:小编 日期:2020-11-26 19:10 点击数:

立体显微镜通常被称为实验室或生产现场的“主力军”。用户花费大量时间通过目镜检查,观察,记录或解剖样本。仔细评估需要立体显微镜的相关应用程序是持久,令人满意的使用的关键。决策者需要确定他们可以完全根据自己的需求定制工具。为了帮助用户在选择体视显微镜时做出决策,此处重点介绍要考虑的主要因素。

立体显微镜历史的简短概述

1890年左右,美国生物学家和动物学家Horatio S. Greenough提出了一种光学仪器的设计原理,该原理至今仍被所有主要制造商所采用[1-3]。基于“ Greenough原理”的立体显微镜可提供高质量的真实立体图像。1950年代后期,博士伦(Bausch&Lomb)提出了其StereoZoom®Greenough设计,该设计具有突破性的创新:无级放大(变焦)变换器[3]。几乎所有现代体视显微镜设计都基于缩放系统。1957年,美国光学公司推出了基于望远镜或CMO(通用主要物镜)原理的光学立体显微镜[3]。除了Greenough型之外,由于其模块化和高性能,所有制造商很快都提供了这种体视显微镜。

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选择体视显微镜前要问的四个主要问题

体视显微镜可能是一笔巨大的投资,因此,选择过程应非常认真。为了充分利用显微镜,用户应该问自己以下问题:

1.什么是应用程序?

  • 是否涉及筛选和分类?
  • 是否需要任何样品处理?
  • 是否需要文件?

2.需要观察,记录或可视化哪些结构?

  • 高分辨率比长工作距离或反之更重要吗?

3.使用显微镜需要多少人?他们将在显微镜下工作几个小时?

  • 长时间使用显微镜时,必须考虑符合人体工程学的附件,因为它们可以防止重复性劳损。
  • 根据不同用户的数量,建议使用可根据每个用户的喜好进行调整的显微镜。

4.显微镜的可用预算是多少?

  • 模块化解决方案看起来可能是一项更高的投资,但从长远来看,由于其多功能性,可容纳不同用户的能力以及各种附件和配件,它们将节省金钱。

选择最适合您需求的显微镜时要考虑的5个关键因素

1.变焦范围,放大倍率,物场(视野)和工作距离

  • 倾向于以相同放大倍数工作的用户不需要较大的变焦范围。
  • 如果工作流程需要搜索,查找和样本处理,那么将放大倍率范围从低放大率变为高放大率可能会很有用。
  • 在相同的变焦倍率下,根据目镜可以看到更大或更小的物场。较大的对象字段允许用户在样品上保持更好的方向。
  • 较大的工作距离意味着样品顶部与物镜的前透镜之间的距离更大,从而在使用过程中易于处理样品。

2.景深和数值孔径(NA)

  • 较高的NA可获得较高的分辨率,但通常会减小景深。
  • FusionOptics技术将高分辨率与更大景深结合在一起。

3.光学质量

  • 平面光学器件:校正整个物场上的图像平坦度,这对于所有应用程序都是有用的。
  • 消色差(消色差)光学器件:对于真实色彩再现不重要且主要评估几何特征的应用。
  • 复消色差(APO;复消色差)光学器件:适用于色带可能会受到干扰的应用,例如那些需要快速换色和结构共定位的应用。
  • 透射:对于需要可视化样品细节的应用,使用具有更好光透射率的高质量光学元件是有利的。对于研发等要求苛刻的应用,具有高透光率的光学器件可以有所作为。
  • 颜色再现:如果准确看到样品的真实颜色很重要,则应使用高质量的光学器件和适当的照明。

4.人机工程学

  • 符合人体工程学的附件可简化显微镜的使用,并加快工作流程。例如,在通过目镜观察样品时,可以轻松调节变焦和聚焦旋钮吗?
  • 如果显微镜是由不同的用户操作的,请确保可以根据每个用户的偏好对其进行调整。

5.照明

  • 最佳照明应均匀地照亮整个视野,提供良好的对比度,并准确显示样品的真实颜色。

深入解释的5个关键因素

1.总放大倍率:物镜,变焦倍率和目镜

立体显微镜的总放大倍率是物镜,变焦光学镜和目镜的总放大倍率[4]。 物镜具有固定的放大倍率值。仪器的变焦光学器件允许在变焦倍数范围内更改放大倍率。目镜也具有恒定的放大率值。 为了找出通过目镜观察到的物体的放大倍率,必须将物镜,变焦光学镜和目镜的放大倍数相乘。

总放大倍率的公式为:M TOT VIS = M O x z x M E,其中: M TOT VIS是总放大倍率(VIS代表“视觉”); M O是物镜的放大倍率(对于不带辅助镜的Greenough系统,则为1倍); z是缩放系数;和 中号Ë是目镜的放大倍率。

通常,M O的值在0.32x到2x之间,z的值在0.63x到16x之间,M E的值在10x到40x之间。

放大倍率对物场的影响 观察目镜时,称为物场的圆形区域变得可见[4]。物场的直径取决于总放大率。例如,放大倍数为10倍的目镜的场号为23。该场号表示在物镜和变焦光学器件的放大倍数为1倍的情况下,通过目镜观察到的物场直径为23毫米。

2.景深:与放大率和分辨率的关系

景深由数值孔径,分辨率和放大倍率之间的相关性确定[5-7]。 为了获得最佳的物体可视化效果,适当调整现代显微镜的设置可以在景深和分辨率之间达到最佳平衡。尤其是在低放大倍率下,可以通过停止(即减小数值孔径)来显着增加景深。因此,要根据物体特征的大小和形状找到分辨率和景深的最佳平衡。

利用FusionOptics技术实现高景深和高分辨率利用 Leica Microsystems的FusionOptics技术[8]实现了一种立体显微镜的精密光学方法,该方法可以同时实现高分辨率和高景深[8]。通过一条光路,观察者的一只眼睛可以看到具有更高分辨率和更低景深的物体图像。同时,另一只眼睛通过另一条光路以较低的分辨率和较高的景深看到了同一物体的图像。人脑将两个单独的图像组合为一个具有高分辨率和高景深的最佳整体图像。

立体显微镜具有2个独立的光束路径

3.通过消色差或复消色差透镜的光学质量

色差是一种畸变,其中镜头无法将所有颜色聚焦到同一会聚点[2,9]。发生这种情况是因为透镜对于不同波长的光(透镜的色散)具有不同的折射率。当在远离其中心轴的点处撞击球面透镜表面的光线的折射程度比在靠近中心的点处入射的光线折射程度更大或更小时,就会发生球差。良好的光学设计的目的是完全减少或消除色差和球差。可以使用以下镜头来限制这些问题的影响:

消色差镜片

  • 校正了在同一平面内聚焦的2个波长(红色和绿色)。
  • 对于可见光谱范围内的标准应用。

复消色差镜片

  • 校正了在同一平面上聚焦的3个波长(红色,绿色,蓝色)。
  • 适用于在可见光谱范围及更高范围内具有最高规格的应用。

平面镜

  • 未进行平面校正的镜头在整个物体(视场)上的聚焦不均匀。
  • 建议用于需要观察大物体场的应用。

4.工作距离严重影响显微镜的可用性

工作距离是物镜在对准焦点时前透镜与样品顶部之间的距离。通常,物镜的工作距离随放大倍率的增加而减小。工作距离直接影响立体显微镜的可用性,尤其是对于检查和质量控制任务。

5.符合人体工程学的最佳效果

借助ErgoTube目镜管,用户可以将身体和头部保持在放松的位置,并且手臂得到很好的支撑,腿部有足够的空间,并且可以坐在椅子上舒适的位置。

通常,人们的身体大小和工作习惯差异很大。因此,配备有特殊附件和特定工作距离的用于特定任务的显微镜的高度(目镜)可能并不适合每个用户。如果观看高度过低,观察者将在工作时被迫向前弯曲,从而导致颈部区域出现肌肉拉紧[10-12]。为了补偿这些高度差,建议使用可变的双目镜筒[10]。由于采用了模块化产品方法,具有CMO设计的体视显微镜提供了多种根据用户的尺寸或工作习惯定制仪器的方法,因此是首选的解决方案。

6.正确的照明使一切与众不同

对于立体显微镜,正确的照明是关键因素[13]。最适当的照明将使目标样本特征以最佳方式可视化,并可能显示新信息。重要的是,照明对于所用的显微镜​​和预期的应用都必须工作良好。

  • 入射光 用于不透明,不透明的样品。根据样品的质地和应用要求,可以使用许多不同的入射照明解决方案来对感兴趣的样品细节和特征进行适当的对比。请参阅 下面的参考文献13,以查看立体显微镜入射照明的一些示例。
  • 透射光 用于各种透明样品,范围从生物样品(例如模型生物)到聚合物和玻璃。
  • 标准透射明场照明 用于所有类型的透明样品,它可提供高对比度和足够的颜色信息。
  • 斜透射照明 用于几乎透明和无色的样品。可以实现更大的对比度和样品的视觉清晰度。
  • 暗场照明 用于样品平坦区域上的小特征,这些特征在明场中不易看到,例如,光泽或明亮样品上的裂缝,气孔,细小突起等。它也可以用于显示尺寸低于分辨率极限的样品结构。
  • 清晰,透明标本的对比方法 Rottermann或浮雕对比度是一种先进的倾斜照明技术,可将折射率的变化显示为亮度的差异。正浮雕对比结构看起来升高,而反浮雕对比结构则降低。正向和反向浮雕反差可以使区分精细结构和从样品中提取最大信息量变得更加容易。

 



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